研究空间关系的是透视学。达·芬奇把透视学分成三个分支：线透视、色透视和隐没透视。分别研究物体的大小、颜色和形状同该物体与眼睛的距离的关系。线透视经过布鲁涅列斯基、佛兰切斯卡等人的研究已经相当完备，不过他们没有考虑到空气的效果和眼睛看不清远处物体这事实，其结果会使画中远景与眼睛看到的实况不符。达·芬奇结合着许多生动的实例，研究空气和雾霭对远景的色彩和形状的影响，创立空气透视和隐没透视。有了空气透视之后，画里的空间就不是真空，而是带有大气的空间了。由于远景和眼睛之间隔有臆胧的氛围，而不是一览无余，空间的深度感就加强了。
一个实体占据一个三维的体积：物体的轮廓线包括了二维，第三维是物体的凹凸。透视学可以在二维的画平面上表现大范围的深度，但不能表现小范围变化的深度（即凹凸）。凹凸感只有借着物体的明暗变化方能表现。佛罗伦萨画派认为物体的凹凸感具有头等重要的意义。达·芬奇写道：“绘画的最大奇迹，就是使平的画面呈现出凹凸感。”他孜孜不倦地研究光和影，除了实际观察外，还作理论性的研究。
例如，研究一个球体上的光和影。这种研究工作虽然抽象，但却是一种基本功，彻底掌握之后可以触类旁通。达·芬奇重视理论研究，由此可见一斑。在明暗处理上，芬奇偏爱丰富的层次，首创明暗转移法即画像上由明到暗的过渡是连续的，像烟雾一般，没有截然的分界。
他告诉学生，画人像时最佳的光线是薄暮时分的柔和光，作户外写生时，如假想太阳为薄薄的云层遮掩，可以使人像柔和。他的油画《蒙娜丽莎》和素描《圣安娜》都是明暗转移法的典范。传记家瓦萨里说，达·芬奇的明暗转移法是绘画艺术的一个转折点，这是很中肯的评语。
至于色彩，达·芬奇抱着佛罗伦萨画派所共同的看法，认为色彩从属于光影（暗色画影，亮色画光），因而未给予足够重视。但尽管如此，他对色彩也有许多卓越的见解，例如，关于物体的颜色和光照、和周围物体的颜色都有关系的观察，在某种程度上为法国印象派色彩理论的嚆矢。
在盛期文艺复兴，绘画在以人为本位的人文主义思想的影响下，思想内容和主要形象都渐渐从神转向人。正如当时著名的人文主义者皮柯·德拉·米兰多拉在一篇宣言式的讲演《论人的尊严》里所宣称“人是世界舞台上一件大奇迹”，“人占据着世界的中心”。
所以，反映到绘画上，人也成为当代绘画的中心。达·芬奇在论述绘画来自经验时说，神的本质，灵魂等问题完全和感觉背道而驰，在论绘画的主旨时说“一个画家应当描绘两件主要的东西：人和他的思想意图”，就是这种排除神学，以人为中心的时代精神的反映。当时的艺术大师们以极大的热情研究人体的比例。在他们看来，人体是自然界中最完美的东西，所以，人体的比例必须合乎数学法则：各部分之间成简单整数比，或与圆形、正方形等完美的几何图形吻合。
他们把人体的比例变成绘画、雕塑和建筑中和谐美的基础。人体研究的第二个重要内容就是人体解剖，他们认为解剖学是真实表现人的形态时必须具备的知识。达·芬奇十分重视解剖学，研究这门学问前后有四十余年。他认为人体解剖是了解人体动态的钥匙。他讥笑有些画家不结合人的动作去研究解剖，结果画出的裸像，肌肉块凸起，活象一袋萝卜。
人体动态表情和心理的描写是达·芬奇的艺术的一个要素。达·芬奇认为“运动是一切生命的源泉”，连素描画里的线条也是点的运动的结果。他喜欢用波浪起伏的曲线去安排人物的姿势，就和这一认识有关。对于人的手势和表情，达·芬奇有这样的看法：人在不做作时的动作、手势和表情必定和这人的思想感情相适应。所以，他把动态、手势、表情看成是绘画里揭示人物内心世界的手段，要求画家笔下人物的动作在任何情况下都应当表现它们的思想感情。达·芬奇的这一人体动态理论对后世的艺术理论和实践有深刻的影响。
风景和大自然研究同样是达·芬奇画论中重要的主题。文艺复兴时代的艺术家，以自然为良师益友，从马萨卓起，风景已是绘画的一个组成部分。达·芬奇更是盛期文艺复兴时代大师中，最擅长以风景作背景的画家。在画论的这一部分笔记里，我们可以找到达·芬奇对风景和自然现象的许多壮丽的描写。
总而言之，达·芬奇的绘画论，把他那个时代里和绘画有关的问题几乎统统讨论到了。他是文艺复兴时代伟大的艺术革新家，在构图法、明暗法、透视法和心理描写等方面有巨大的贡献，又是历史上有数的学识最渊博的巨人。那部汇集他毕生经验写成的画论，可以称得上是一部总结了他那个时代绘画艺术的成就的百科全书。值得惊奇的倒是他的许多观点在四百年后的今天看来，还有它的现实意义，可供我们借鉴。达·芬奇的生命是一条没有走完的道路，路上是撒满了未完成作品的零章碎片。他在临终前痛心地说过：“我一生从未完成一项工作。”·达·芬奇独特的艺术语言是运用明暗法创造平面形象的立体感。
